Die Reverse Transkriptase bindet einzelsträngige RNA und bildet dazu einen komplementären DNA-Strang (Polymerase-Funktion des Enzyms). Danach baut es den RNA-Strang des entstandenen DNA/RNA-Hybridmoleküls ab (Nuklease-Funktion des Enzyms). Für diese Reaktionen besitzt die Reverse Transkriptase zwei verschiedene aktive Zentren.